Tematy zajęć seminaryjnych z przedmiotu BIOLOGIA MOLEKULARNA dla studentów II roku wydziału Lekarskiego
Seminarium I. Informacja genetyczna – podstawy molekularne.
- Pojęcie informacji genetycznej (genomu) i genu jako jednostki informacji genetycznej.
- Kwasy nukleinowe jako cząsteczki informatyczne: budowa, właściwości fizyko-chemiczne i funkcje kwasów nukleinowych.
- Właściwości kwasów nukleinowych umożliwiające ich funkcjonowanie jako biologicznych cząsteczek informatycznych (budowa, biegunowość i długość łańcuchów, swoiste oddziaływanie zasad, kopiowanie na zasadzie komplementarności, uniwersalność budowy).
Zapisywanie sekwencji nukleotydów w łańcuchach DNA i RNA. Komputerowe bazy sekwencji kwasów nukleinowych.
Podwójna helisa DNA – znaczenie dla stabilności i funkcjonowania jako cząsteczki informatycznej.
Denaturacja i renaturacja kwasów nukleinowych. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – podstawowa metoda badawcza w biologii molekularnej.
- Organizacja i funkcje chromatyny jąder komórek eukariotycznych. Histony i białka niehistonowe. Euchromatyna i heterochromatyna. Chromosomy mitotyczne.
Seminarium II. Realizacja informacji genetycznej - ekspresja genów
- Realizacja informacji genetycznej w komórce – ekspresja genów. Centralny dogmat biologii molekularnej.
Geny kodujące polipeptydy i funkcjonalne cząsteczki RNA.
Budowa genu (sekwencje regulatorowe i kodujące, promotory genów, nieciągłość większości genów wyższych eukariotów).
Rozmiary genów ludzkich. Zależność pomiędzy wielkością genu a ilością intronów.
Kod genetyczny, jego właściwości oraz wpływ na skutki fenotypowe małych mutacji. Pojęcie otwartej ramki odczytu (open reading frame, ORF).
- Główne etapy ekspresji genów (transkrypcja, dojrzewanie pierwotnych transkryptów, translacja, obróbka posttranslacyjna białek).
Synteza RNA kopii genu pod czas transkrypcji – rola polimeraz RNA.
Nici sensowne (kodujące) i antysensowne genów.
Rodzaje polimeraz RNA komórek eukariotycznych.
Znaczenie promotorów genów w rozpoczęciu transkrypcji.
Charakterystyka promotorów genów bakteryjnych i eukariotycznych.
Rola podstawowych czynników transkrypcyjnych (general transcription factors, GTFs) w komórkach eukariotycznych (rozpoznawanie promorotu i właściwe umieszczenie polimerazy RNA).
Promotory alternatywne niektórych genów.
Kompleks preinicjacji transkrypcji na promotorze i opuszczenie przez polimerazę RNA promotoru.
Terminacja transkrypcji.
- Posttranskrypcyjna obróbka pierwotnych transkryptów.
Modyfikacja końców 5’(kapowanie) i 3’(synteza ogona polyA) premRNA.
Splicing intronów (znaczenie sekwencji konserwatywnych intronowych oraz U-snRNPs). Splicing alternatywny. Kryptyczne sekwencje intronowe. Mutacje splicingowe.
Redagowanie (editing) pre-mRNA.
Modyfikacje chemiczne nukleotydów w pierwotnych transkryptach rRNA i tRNA. Udział snoRNA.
Procesing pierwotnych transkryptów genów rRNA.
Transport dojrzałych transkryptów w cytoplazmę.
- Translacja i posttranslacyjna obróbka białek
Struktura i funkcje rybosomów
Odczytywanie sekwencji kodonów w ORF mRNA przez cząsteczki tRNA załadowane aminokwasami (aminoacylo-tRNAs).
Funkcja enzymów aminoacylo-tRNA syntetaz.
Terminacja syntezy łańcucha polipeptydowego.
Obróbka posttranslacyjna polipeptydów (fałdowanie, modyfikacje chemiczne aminokwasów, transport w komórce).
Seminarium III. Regulacja ekspresji genów.
- Molekularne podstawy różnicowania komórek organizmów wielokomórkowych oraz rozwoju osobniczego organizmu – zróżnicowana ekspresja genów (regulacja ekspresji genów) oraz mechanizmy epigenetyczne (metylacja promotorów genów, zmiany w upakowaniu chromatyny).
Geny konstytutywne („gospodarstwa domowego”, house-keeping) i indukowane.
Geny imunoglobulinów i receptorów limfocytów .
- Poziomy regulacji – na poziomie inicjacji transkrypcji (najbardziej istotny), dojrzewania pierwotnych transkryptów (alternatywny splicing i editing), transportu mRNA w cytoplazmę oraz stabilności dojrzałych cząsteczek mRNA (interferencja RNA).
Udział swoistych czynników transkrypcyjnych (tran-elementów regulatorowych genów) w regulacji inicjacji transkrypcji – cechy charakterystyczne i molekularne mechanizmy działania czynników transkrypcyjnych.
Udział sekwencji regulatorowych genów (cis-elementów regulatorowych) w regulacji inicjacji transkrypcji – charakterystyka i rodzaje sekwencji regulatorowych genów.
Effekty mutacji w obrębie sekwencji regulatorowych.
Regulacja splicingu i redagowania mRNA.
- Mechanizmy molekularne regulacji ilości i aktywności swoistych czynników transkrypcyjnych – wpływ czynników środowiska wewnętrznego i zewnętrznego komórki. Powiązanie ekspresji genów z sygnalizacją komórkową.
- Epigenetyczne mechanizmy regulacji ekspresji genów.
Metylacja promotorów genów – sposób na trwałe i dziedziczone wyciszenie aktywności genów.
Enzymy katalizujące proces metylacji DNA.
Metylacja de-novo i semikonserwatywna.
Udział metylacji w procesach inaktywacji chromosomu X oraz piętnowaniu rodzicielskim.
Zaburzenie procesów metylacji DNA w komórkach nowotworowych.
- Regulacja stabilności mRNA w cytoplazmie. Udział microRNA i innych regulatorowych funkcjonalnych cząsteczek RNA.
Terapeutyczne cząsteczki siRNA.
Seminarium IV. Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za utrzymanie stabilności genomów i zróżnicowanie genetyczne osobników.
- Replikacja DNA – utworzenie dokładnej kopii genomu przed podziałem komórki.
Mechanizm replikacji. Pojęcie widełek replikacyjnych.
Udział polimerazy DNA i innych enzymów i białek w replikacji.
Kierunek syntezy nowej nici przez polimerazy DNA oraz zależność polimerazy od matrycy i startera związanego z matrycą.
Zastosowanie polimeraz DNA w reakcji PCR.
Nici wiodąca i opóźniona w syntezie DNA – konieczność syntezy jednej z nici w postaci fragmentów Okazaki. Inicjacja syntezy i łączenie fragmentów Okazaki.
Sprzężenie replikacji DNA z podziałem komórkowym (inicjacja replikacji, regulacja przebiegu i zakończenia replikacji)
- Problem replikacji końców chromosomów. Telomery i telomeraza.
Skrócenie końców chromosomów przy każdym podziale komórki.
Zegar biologiczny komórek.
Budowa telomerów chromosomowych.
Struktura i aktywność telomerazy.
Aktywacje telomerazy w komórkach nowotworowych.
- Wierność i błędy replikacji DNA.
Błędy replikacji – przyczyna mutacji punktowych w DNA.
Błędy replikacji samoistne (spowodowane tautomeryzacją zasad lub poślizgiem polimerazy na krótkich tandemowych sekwencjach powtórzonych) i indukowane uszkodzeniem DNA (modyfikacjami chemicznymi nukleotydów lub łańcuchów).
Najczęstsze typy (samoistna lub indukowana deaminacja i alkilacja zasad azotowych, depunynacja i depirymidynacja nukleotydów, zmiany oksydacyjne, pęknięcia łańcuchów) i przyczyny uszkodzenia DNA (samoistne lub indukowane czynnikami mutagennymi wewnętrznymi i zewnętrznymi).
Aktywność korygująca polimeraz DNA (aktywność 3’-5’-eksonukleazy).
Naprawa samoistnych błędów replikacji prze układ naprawy błędnie sparowanych nukleotydów (MMR).
Mutacji genów z układu MMR – przyczyna zespołu Lyncha.
- Komórkowe układy naprawy DNA.
Mechanizmy molekularne bezpośredniej naprawy DNA i naprawy przez wycinanie zasad lub nukleotydów.
Układy naprawy przez wycinanie zasad (BER, base excision repair) i nukleotydów (NER, nucleotide excision repair).
Naprawa pęknięć dwuniciowych w DNA – z udziałem i bez udziału rekombinacji homologicznej. Mutagenny charakter naprawy pęknięć bez udziału rekombinacji (NHEJ).
Odpowiedź komórki na uszkodzenie DNA.
Wrodzone zespoły niedoborów układów naprawy DNA.
- Rekombinacja genetyczna – wymiana fragmentami pomiędzy dwoma cząsteczkami DNA.
Rekombinacja homologiczna (uprawniona) i niehomologiczna (nieuprawniona).
Rekombinacja nieuprawniona oraz asymetryczny crossing-over – źródło mutacji typu delecje i insercje.
Transpozony (ruchome elementy genetyczne) i transpozycja genetyczna.
Błędy podziałów komórkowych jako przyczyna aberracji chromosomowych
Seminarium V. Charakterystyka i analiza genomu ludzkiego
- Projekt Poznania Genomu Człowieka (HGP).
Odczytanie sekwencji nukleotydowych DNA wszystkich chromosomów ludzkich – stworzenie dokładnych map fizycznych chromosomów.
Komputerowe bazy sekwencji genów i transkryptów.
Struktura genomu ludzkiego – geny kodujące polipeptydy i czynne cząsteczki RNA.
Pseudogeny i fragmenty genów.
Obszary niekodujące w genomie jądrowym i mitochondrialnym człowieka.
Sekwencje unikatowe i powtórzone. Rodzaje sekwencji powtórzonych (powtórzone geny, sekwencje satelitarne, minisatelitarne i mikrosatelitarne). Wysoce polimorficzny charakter sekwencji mikrosatelitarnych.
- Stopień zróżnicowania genetycznego wewnątrzgatunkowego (na przykładzie genomu ludzkiego – wyniki Projektu Poznania Genomu Człowieka –Human Genome Project, HGP).
Przyczyny pojawienia się wariantów sekwencji nukleotydów (alleli) w DNA – mutacje i dobór naturalny.
Mutacje utraty funkcji (loss-of-function) i nabycia funkcji (gain-of-function). Mutacje dominujące i recesywne.
Rodzaje wariantów genetycznych – patogenne (często nazywane mutacjami), niepatogenne (również nazywane polimorfizmami), o nieznanym znaczeniu klinicznym.
Typy mutacji – genowe i aberracje chromosomowe; substytucje, delecje i insercje, translokacje i inwersje; germinalne i somatyczne
Typy polimorfizmów genetycznych – pojedynczego nukleotydu (SNP), długości fragmentów (STR i VNTR) i liczby kopii sekwencji (CNV).
Bazy komputerowe zróżnicowań sekwencji nukleotydowych oraz programy do porównywania sekwencji.
Pojęcie choroby genetycznej i wrodzonej podatności na chorobę. Udział alleli polimorficznych w powstawaniu chorób oraz wrażliwości na leki. Genetyczny „paszport” człowieka. Indywidualizacja procesu leczniczego.
Złożone relacje genotypowo-fenotypowe.
Farmakogenetyka i farmakogenomika. Polimorfizm genów związanych z metabolizmem leków.
- Podstawowe techniki analizy kwasów nukleinowych wykorzystywane w diagnostyce molekularnej.
Analiza struktury (sekwencji nukleotydów) i funkcji (aktywności genów – ekspresji) kwasów nukleinowych.
Analiza in situ oraz izolacja DNA i RNA.
Ocena jakości i stężenia kwasów nukleinowych w roztworach. Elektroforeza kwasów nukleinowych.
Powielenie (amplifikacja) wybranych fragmentów DNA i RNA techniką PCR i RT-PCR.
Ocena ilościowa fragmentów DNA lub transkryptów techniką PCR w czasie rzeczywistym.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych.
Metody wykrywania wariantów sekwencyjnych znanych (RFLP – wykorzystanie enzymów restrykcyjnych, allelo-swoistych sond i starterów PCR) i nieznanych (metody przesiewowe i sekwencjonowanie DNA).
Nowoczesne metody analizy genomów i transkryptomów komórek (sekwencjonowanie nowej generacji, mikromacierzy CGH i ekspresyjne).
- Manipulowanie cząsteczkami kwasów nukleinowych.
Klonowanie genów. Biblioteki genowe i cDNA.
Rekombinowane białka.
Organizmy transgeniczne.
Terapia genowa.