Tematy ćwiczeń z Diagnostyki Molekularnej dla studentów III roku Analityki Medycznej

1. Rodzaje, zasady pobierania, transportu oraz przechowywania materiału biologicznego, przeznaczonego do diagnostyki molekularnej

Podstawowe techniki izolacji kwasów nukleinowych – metody organiczna, adsorpcyjna/kolumienkowa oraz magnetyczna. Urządzenia do automatycznej izolacji DNA/RNA

2. Izolowanie DNA genomowego z krwi pełnej przez studentów za pomocą zestawu odczynników f. A&A Biotechnology

Ocena stężenia i czystości wyizolowanego DNA metodami spektrofotometryczną i fluorometryczną – pomiar stężenia DNA w izolatach przez studentów na aparacie Nanodrop

3. Elektroforeza kwasów nukleinowych – rodzaje nośników i zastosowanie w analizie Dna i RNA

Przygotowanie żelu agarozowego i analiza elektroforetycxna wyizolowanego DNA przez studentów

4. Techniki amplifikacji kwasów nukleinowych i ich zastosowanie w diagnostyce molekularnej (PCR, amplifikacja izotermiczna)

Projektowanie przez studentów starterów oraz ustalenie profilu termicznego reakcji PCR

5. Przygotowanie przez studentów mieszaniny reakcyjnej  PCR oraz amplifikacja fragmentów wybranych genów ludzkich

Ocena elektroforetyczna produktów amplifikacji

6. PCR w czasie rzeczywistym – zasady, rodzaje oraz główne zastosowania metody w diagnostyce molekularnej (wykrywanie mikroorganizmów i ocena ich miana w materiale biologicznym, wykrywanie „ znanych” mutacji chorobotwórczych, analiza polimorfizmów punktowych – SNP, indeli)
7. Dyskryminacja alleli – detekcja alleli SNP techniką PCR w czasie rzeczywistym z użyciem allelo-swoistych sond hybrydyzacyjnych ( odczynniki f. AppliedBiosystems)
8. Detekcja wybranych gatunków mikroorganizmów przez studentów za pomocą swoistych testów, opartych na reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Analiza ilościowa – ocena miana CMV w surowicy krwi/moczu (wartości Ct, krzywa wzorcowa). Znaczenie kontroli wewnętrznej reakcji do oceny wiarygodności wyniku
9. Panele testów mikrobiologicznych (oddechowy, zakażeń układu pokarmowego i innych) i ich zastosowanie w diagnostyce. Przygotowanie kilku rekacji multiplex PCR z wyznakowanymi różnymi barwnikami fluorescyjnymi sondami do wykrywania różnych patogenów w pojedynczej analizie.
10. Sekwencjonowanie DNA – podstawowa technika wykrywania mutacji chorobotwórczych i polimorfizmów genetycznych. Sekwencjonowanie tradycyjne (Sangera i pirosekwencjonowanie) oraz techniki sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Zastosowanie w wykrywaniu mutacji, odpowiedzialnych za choroby dziedziczne oraz polimorfizmów genetycznych

Przygotowanie przez studentów matrycy do sekwencjonowania Sangera oraz biblioteki do NGS – ścieżka postępowania.

11. Analiza sekwencji pod względem występowania wariantów sekwencji i ocena znaczenia funkcjonalnego wykrytego wariantu – wykorzystanie programu BLAST oraz baz internetowych sekwencji (ClinVar, OMIM). Analiza raportów bioinformatycznych NGS

Zasady opisu różnych rodzajów wariantów sekwencyjnych w analizach diagnostyki molekularnej – wykorzystanie regulacji HGVS (Human Genome Variation Society)

12. Wykrywanie mutacji onkogennych w guzach chorych na nowotwory narządów litych – materiał biologiczny (izolacja DNA i RNA z kostek parafinowych), testy do wykrywania mutacji genowych (oparte na RT-PCR i NGS) oraz translokacji i fuzji genowych (analiza RNA). Wykorzystanie baz internetowych (ClinVar, COSMIC). Diagnostyka hemoonkologiczna. Znaczenie diagnostyki molekularnej w terapii celowanej
13. Techniki hybrydyzacyjne wykorzystywane w diagnostyce molekularnej – testy paskowe i mikromacierzowe. Genotypowanie wirusa HCV za pomocą testu paskowego
14. Ocena sekwencji paneli polimorficznych mikrosatelitarnych w medycynie sądowej do identyfikacji osobników. Wykorzystanie elektroforezy kapilarnej i ocena prawdopodobieństwa
15. Regulacje prawne dotyczące laboratoriów diagnostyki molekularnej