Tematy ćwiczeń z przedmiotu BIOLOGIA MOLEKULARNA dla studentów IV roku kierunku Farmacja Apteczna
- Charakterystyka, pobieranie, przechowywanie i transport materiału biologicznego przeznaczonego do analizy kwasów nukleinowych (materiał przeznaczony do izolacji DNA w przypadku diagnostyki chorób dziedzicznych, nowotworowych oraz zakaźnych; materiał przeznaczony do izolacji RNA, roztwory stabilizujące RNA).
Podstawy metod izolacji kwasów nukleinowych (pierwotna obróbka materiału biologicznego, liza komórek i struktur wewnątrzkomórkowych, odseparowanie kwasów nukleinowych od innych makrocząsteczek komórkowych, wytrącenie kwasów nukleinowych z roztworów) i przechowywanie wyizolowanych cząsteczek.
Izolacja DNA i RNA oraz spektrofotometryczna ocena stężenia i jakości cząsteczek (metody izolacji – fenolowanie, kolumienkowa, magnetyczna; komercyjne zestawy do izolacji DNA, izolacja automatyczna. Właściwości spektrofotometryczne kwasów nukleinowych, ocena stężenia i czystości roztworów DNA i RNA).
Samodzielna praca studenta - izolacja DNA z krwi metodą kolumienkową i ocena otrzymanego roztworu na aparacie NanoDrop.
Elektroforeza uzyskanego DNA.
- Reakcja PCR – podstawy metody (skład mieszaniny reakcyjnej, profil termiczny reakcji, projektowanie starterów reakcji, praca z bazami genów). Reakcja odwrotnej transkrypcji (podstawa metody, stosowane startery i polimerazy). Analiza produktów amplifikacji. Rodzaje PCR i ich zastosowanie (wykorzystanie elektroforezy do analizy produktów amplifikacji, czułość i swoistość amplifikacji, rodzaje PCR, analiza analityczna i preparatywna).
Samodzielna praca studenta – zaprojektowanie starterów dla wybranego fragmentu genomu człowieka (KRAS) oraz genomu wirusowego (CMV). Obliczenie składników reakcji PCR. Nastawienie reakcji PCR oraz odwrotnej transkrypcji. Wykonanie elektroforezy produktów amplifikacji i analiza otrzymanych wyników.
- Reakcja PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, RT-PCR) – podstawy metody (dynamika reakcji PCR, metody znakowania syntetyzowanego produktu PCR – barwniki interkalujące i swoiste sondy; pomiar fluorescencji w czasie reakcji, aparaty do real-time PCR, gotowe mieszaniny reakcyjne i zestawy startery/sonda do reakcji). Zastosowania PCR w czasie rzeczywistym do oceny ilościowej wybranego fragmentu DNA (analiza z krzywą wzorcową) (zastosowanie analizy ilościowej w diagnostyce molekularnej, ocena amplifikacji – pojęcie progu i wartości Ct reakcji, parametry krzywej wzorcowej). Zastosowanie PCR w czasie rzeczywistym do badań nad ekspresją genów (analiza względna) (jedno- i dwuetapowy proces amplifikacji mRNA techniką RT-PCR, charakterystyka procesu amplifikacji, konieczność normalizacji wyników, obliczenie względnej ekspresji analizowanego genu – metoda deltadeltaCt). Ocena liczby kopii genu w komórce metodą analizy względnej.
Samodzielna praca studenta – zaprojektowanie i nastawienie reakcji RT-PCR w kierunku oceny ilościowej wiremii wirusa CMV. Obliczenie wiremii. Zaprojektowanie i nastawienie reakcji odwrotnej transkrypcji i RT-PCR dla mRNA ludzkiego genu AURKB. Analiza przebiegu amplifikacji mRNA, obliczenie względnej ekspresji badanego genu.
- Wykrywanie wariantów genetycznych (mutacji i polimorfizmów) – wykrywanie znanych mutacji (pojęcie znanego wariantu genetycznego, najczęściej stosowane metody diagnostyczne – elektroforeza poliakryloamidowa (PAA), RFLP, ASO, allelic discrimination; enzymy restrykcyjne i technika RFLP). Wykrywanie nieznanych wariantów genetycznych (mutacji i polimorfizmów) – techniki przesiewowe i sekwencjonowanie DNA (wysoce rozdzielcza analiza topnienia DNA – HRMA i inne metody przesiewowe, sekwencjonowanie metodą terminacji syntezy łańcucha – Sangera, automatyczne sekwenatory DNA i analiza elektroforegramów, pirosekwencjonowanie). Wysoceprzepustowe metody DNA – sekwencjonowanie DNA nowej i trzeciej generacji. Metody bioinformatyczne opracowywania otrzymanych wyników sekwencjonowania.
Samodzielna praca studenta – Trawienie produktu amplifikacji I eksonu genu KRAS enzymem restrykcyjnym BstO i elektroforeza produktów trawienia. Oczyszczanie i nastawienie reakcji sekwencjonowania produktu amplifikacji I eksonu genu KRAS, oczyszczanie produktu sekwencjonowania i wykonanie sekwencjonowania na aparacie 3500 Genetic Analyzer. Analiza sekwencji, porównanie sekwencji z sekwencjami w bazach genowych z użyciem programu BLASTN.
- Techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych (podstawa i rodzaje techniki hybrydyzacji – hybrydyzacja na paskach, hybrydyzacja in situ (ISH), porównawcza hybrydyzacji genomowa (CGH) oraz mikromacierzy DNA. CGH z zastosowaniem mikromacierzy (aCGH), wykorzystanie sond w innych badaniach molekularnych – np. RT-PCR). Analiza ekspresji genów za pomocą mikromacierzy (macierzy ekspresyjne i miRNA, postępowanie przy wykonaniu analizy, opracowywanie wyników, analiza bioinformatyczna)
Samodzielna praca studenta – Genotypowanie wirusa HCV za pomocą testu paskowego – wykonanie badania i analiza uzyskanych wyników. Zaprojektowanie eksperymentu aCGH, analiza wyników aCGH za pomocą programu CytoGenomics.
Zaliczenie końcowe